TBAF （テトラブチルアンモニウムフルオリド）

バタバタ忙しくて、更新できてなくてすみません。仕事に追われてなかなか時間が取れなかったです。TBAFについて、調べ直しする必要があったので、せっかくなのでまとめてみました。　RNA化学合成後の2'-TBDMS (TBS)基の脱保護には、TEA·3HFが広く用いられています。少し前(だいぶ前?) は、TBAF (tetrabutylammonium fluoride)が用いられていました。TBAFの含水量によって、RNAの脱保護時の脱シリル反応が遅くなる(進行しなくなる)との報告(Hogrefe_1993_NAR)があり、含水量による反応の再現性が得られにくいので、TEA·3HF (Westmanu_1994_NAR)が使いやすいということになってきたのかと思います。　さてTBAFですが、3水和物〜4水和物くらいのものが固体の試薬として市販されています。かなりの潮解性です。含水量を気にして、しっかりとシールされている1 M TBAF/THFの溶液を何度も購入しました。そのほかTHF溶液にモレキュラーシーブを入れたりして・・・（今から思うと過酸化物怖い）。　TBAFの水和水ですが、試薬の安定性に極めて重要な役割をしていて、この水和水を除去すると、試薬が分解してしまいます。TBAFの水和水を除くため、脱水のアセトニトリルを使って、エバポレータで共沸脱水したことがあります。すると、2、3回の共沸脱水操作（バス温40°C以下だったと）で、試薬が着色、分解してしまいました。後から調べたら文献(Sharma_1983_JOC)でも報告があり、加温、減圧乾燥で、ホフマン分解が進行してしまい、トリブチルアミン、HF、1-ブテンが生成するとの報告がありました。ホフマン分解のメカニズムは、4級アンモニウムのβ-位の水素がF^-で引き抜かれ、レトロマイケルで進行するのですが、このように、Naked F^-の水素結合アクセプター性は、共存する水や、溶媒などにより大きく影響を受けるということがわかります。TBAFは、中性だとか塩基性だとか色々言われていますが、溶媒和によってその水素結合アクセプター性が変化するので、単純な中性、塩基性の議論で済まないと思っています。　ほかのブログさん（たゆまずとも沈まずー有機化学のあれこれ）で、無水TBAFの紹介がされていますが、無水TBAFは、hexafluorobenzeneとtetrabutylammonium cyanideから、低温で合成できるとの報告があり(Haoran_2005_JACS)、その反応有用性も報告されています。また、Naked F^-については、窒素より原子半径が大きい、ホスホニウムカチオンとの組み合わせで、テトラメチルホスホニウムフルオリドの報告がありますが、アセトニトリルの水素原子を引き抜いてしまうほどその水素結合アクセプター性はかなり強いです(Hohenstein_2010_ZEITSCHRIFT FÜR NATURFORSCHUNG B)。　今回の機会に、TBAFのことを調べてみると、TBAF(tBuOH)4 は結晶性が高く、潮解性が低く、TBAF(H₂O)_xから合成でき使いやすいとの報告(Kim_2008_Angew)や、pinacol錯体が販売されていたり、実験していない間に化学が進歩している様です。使ってみたい試薬たち。　RNAの脱保護だけではなく、通常の有機合成でも、個人的にシリル系保護基の脱保護には、TEA·3HFがオススメです、TBAFのテトラブチルアンモニウムカチオンが精製時に厄介ですよね。

Mila's Mir⭐️cle Foundation

　n = 1の臨床試験が行われているアンチセンス薬ミラセン（Milasen）。Milaちゃんという、バッテン病の患者のためのエキソンスキッピング型MOEのASO薬です。Milaちゃんのお母さんのトランスポゾン変異が原因で、この遺伝子変異によるバッテン病患者は、世界中でMilaちゃんだけ。Milasenは患者1人のための究極のテイラーメイド医薬品です。
　トランスポゾン変異によりMFSD8遺伝子に挿入された核酸の塩基配列が、スプライシング産物(RNA)に組み込まれ、終止コドン配列(AUG)が挿入されることにより、正常なタンパク質翻訳が行なわれないことが、Milaちゃんの病気の原因です。Milasenは、pre-mRNAのトランスポゾン挿入部分に相補的なASOであり、ASOの投与で挿入配列がスキップされた成熟mRNAが増加、正常なタンパク質が生成されます。
　ASOを用いた治療が計画されてから、実際に投与されるまで10ヶ月、文献上ではたった7つのASOから臨床化合物が選択されました（Kim_2019_NEJM）。承認薬ヌシネルセンと類似のスプライシング制御薬である点、Chemistry（MOE-PSオリゴ）及び投与経路（髄腔内投与）もヌシネルセンと同じ、患者の重篤性、希少性からFDAが臨床試験を許可したと言われています。
　ご両親は、Mila's Miracle Foundationという基金を設立し、300万ドルを集めこの医薬品研究資金に使ったとされていますが、どう考えても300万ドルでは足りないです。この研究に携わった研究者、Ionisの協力なしではなし得なかったプロジェクトです。
　このスピード感、対象疾患が遺伝子変異に対する点がまさしく核酸医薬品らしいと思いました。n = 1の臨床試験での医薬品開発は、医薬品ビジネスとしては成立しづらいと思います。しかし確立されたプラットフォームと、公的な資金やリソースの助けがあれば、「苦しむ患者に1年足らずで投与される薬剤が創生される時代」がそこまできていると感じさせられました。
　Milasenについては、愛し野内科クリニックの愛し野だよりで日本語で詳しくご説明されています。

ゾルゲンスマ承認で思うこと。

　FDAがSMAの遺伝子治療薬ゾルゲンスマを承認しました。薬価は、2.3億円。この値段は高い・安い色々な意見があがっていますね。1回の治療で完治するのであれば、私は安いのかなと思います。核酸医薬品のSMA治療薬スピンラザは、1年目は6回投与、2年目以降は3回で、アメリカでの薬価は、1年目8000万円超ですので、明らかにゾルゲンスマは安いです。
　致死性の遺伝性疾患に対して、新たなモダリティにより人命が救われ、子供達が将来を描けるようになることは、素晴らしいことだと思います。どんどん医療が発達して、救われる命が増えることを願います。
　一方、核酸医薬品として初めて商業的に成功したとされるスピンラザはシェアを奪われることになるでしょう、薬価も下がるかもしれません。様々なモダリティが、それぞれに適した疾患に合わせて選択される時代になったということですね。
　

C9orf72-related disorder

ご無沙汰しており申し訳ありません。
今年もどうぞよろしくお願いします。
仕事などなどで、時間が取れず更新滞ってます。すみません。読みたい論文もあるのですが、なかなかです。

特許検索をしていたら、waveの特許が公開されていましたので、共有させてもらいます。
2/14のバレンタインの日に、公開になっていたようです。
本来ならば、斜め読みでもして、レビューっぽくすればよいのですが、2つ同時に公開されているうえ、両方足すと1000ページ。審査官も大変です。いずれもC9orf72に関するもののようです。
これまで、waveの情報はほとんど出てこなかったですが、今後はかなりの内容が学会などでも発表されるのではと楽しみにしています。

wave-1

wave-2

アミダノイト

師匠も走る師走で、ようやく寒くなってきました。寒いと活動が鈍くなるのが嫌です。
最近いろんなところで、ブログしてますか？とお声かけをいただいています。ありがとうございます。ですがなかなか更新できていなくて申し訳ないです、すみません。chemstationの核酸版にするんですか？と言っていただいたりしましたが、時間の余裕がなくて。メジャーなサイトさんはすごいなと思います。

amiditeのカタカナは、アミダイトだと思っていたのですが、色々な方がアミダイドとトが濁っているのを使われているので、google検索してみました(google chrome、シークレットモード)。

アミダイト
約 45,200 件 （0.26 秒）
アミダイド
約 388 件 （0.25 秒）

やはりアミダイトのようです。アミダイドで検索たら、検索で出てくるサイトの上位は特許が多かったです。何かしらの意図があるのかもしれません。

”あみだいと”を漢字に変換すると、”阿弥陀糸”になることはないですか。
そのまま検索すると、阿弥陀の糸という曲が検索されます。

阿弥陀糸
 約 1,860,000 件 （0.40 秒） 

2018年7月発表DracoVirgoの曲だそうです。

お寒いですが、みなさま風邪など引きませんように。

アミダイトの分解反応〜加水分解の先

　核酸オリゴの合成でアミダイトの溶液には、モレキュラーシーブスを入れる派？入れない派？
私は入れる派です。しかもできればペレットを使いたいです。パック詰めの粉のも購入できますが、高い！。ペレットからも粉がでて合成機に吸い込まれるのが嫌ですが、チューブにフィルターをつける派？つけない派？いろいろありますね。
　アミダイトの乾燥があまいと、アクチベーターと混ぜた瞬間に水と反応し、アミダイトが縮合前に加水分解してしまったり、そもそもアミダイト自体がアセトニトリル溶液中で、徐々に加水分解することが考えられますね。加水分解だけが問題となるならば、系中の水が消費されればそれで終わりなのですが、その先の分解反応が実はあんまり知られていません。会社の若手とのディスカッションで、昔読んだ論文のことを思い出しました。
　2004年のNucleosides, Nucleotides & Nucleic AcidsでIsis(現Ionis)のグループがアミダイトの分解反応について報告しています。DNAの標準的なアミダイトをアセトニトリルに溶解させ、経時変化をHPLCで分析しています。0.2 MのG(ibu)のアミダイトの溶液では、純度99%のアミダイトが10日で91.5%まで下がるとのことです。他のA、C、Tではそんなに分解しません。

　アミダイトが加水分解するとCE-H-ホスホネートが生成します。加水分解だけではココで終わりですが、この加水分解で副生するジイソプロピルアミンやアミダイト自体の塩基性で、H-ホスホネートのシアノエチル基がbeta-脱離し、H-ホスホネートモノエステルと、アクリロニトリルが生成します。一旦アクリロニトリルが生成するとアミダイトの分解反応は別のメカニズムで進行し始めます。アミダイトのリン原子がマイケル付加でアクリロニトリル付加体となり、この付加体からO-(2-シアノエチル）部分でさらにbeta-脱離が進行し、アクリロニトリルがまた生成します。つまりアクリロニトリルがアミダイトの分解を触媒し続けるということを示しています。
　この論文では、モレキュラーシーブスを共存させると分解反応は、抑えられるとも報告しています。
　リン周りの立体障害の少ないDNAのアミダイトの話です。より立体障害のあるRNAやLNAなどでは、もう少し安定なのかもしれません。（縮合効率が悪いですし、反応効率も違いますよね。）


　

5価のリン化合物によるキラルなホスホロチオエートDNA合成

　すでにいろんなところで取り上げられているKunouseらのScience誌の論文ですが、本ブログでも取り上げないわけにはいかない極めて重要な論文です。合成だけでScienceに掲載されるのはインパクトとキラルなホスホロチオエートの話題性が高いということですね。Scripps研とBMS(Bristol-Myers Squibb)の共著で、サプリメントの資料も220ページでボリュームたっぷり。タイトルどおり、5価のリン化合物をモノマーユニットとして用いてキラルなホスホロチオエートDNA2量体やオリゴの合成を行なっています。

　リモネンから過酸化水素で酸化して合成したリモネンオキシドを不斉源として不斉リン化合物を合成しています。やはり天然の不斉炭素は重要ですね！。論文では、様々なエポキシを検討したような図が出ていましたが、比較実験のデータは見つけられませんでした。脱離基のSC6F5もしかり。
　得られたリン化合物をDBUの強塩基条件で、5'-水酸基が保護されたヌクレオシドと反応させることによって、3'-水酸基に導入しモノマーユニットとします。
　このユニットをさらにDBU存在下で5'-水酸基が遊離しているヌクレオシ(チ)ドと反応させることにより、ヌクレオチド間の結合がキラルなホスホロチオエートDNAを合成することができます(d.r. >99%)。
　ヌクレオチド2量体のほか、環状のヌクレオチド2量体、オリゴ合成に応用しています。
　素晴らしい！⭐️。

メリットは、
>5価のリンなので、空気酸化や加水分解を受けにくい。
>リモネンから誘導した不斉補助基で工程数が少ない、安い。
>塩基部位が無保護でもいける？。（←DBUでの反応中でアシル型の保護基は脱落している様子)
低分子の不斉ホスホロチオエートDNA合成には、5価のリンが使いやすい。STING、抗ウイルス剤などは、こちらが向いているとのことかな。

これからのところ、
オリゴ合成には縮合収率がいまいち。塩基部の反応性はどうなってるのか？保護基の有無など。
とくに水酸基と同じ求核種のチミジンのO4, グアノシンO6位との反応選択性についてどうなのかと思う。DMTrを活用したオリゴマー合成を考えた時には、塩基部の保護がDBUの条件下でも安定かつ、DMTr除去の酸性条件で安定な、オルソゴナルな保護基が必要なのかなと思いました。
サプリメント資料を真面目に読むと、塩基部アシル型の保護のモノマーを合成しているが、どうも収率があまりDMTr-Bz-A(Rp): 51%、DMTr-Bz-C(Rp): 45%、DMTr-iBu-G(Rp): 30%。それを用いて4塩基を含むオリゴ合成はやっているんだけど、本文には出してない、HPLCデータなし。

Science誌だから仕方ないのかもしれないですが、もう少し化学に関する議論があってもいいのにと思いました。サプリメント読むの疲れました。

過去記事: キラルなホスホロチオエート