5価のリン化合物によるキラルなホスホロチオエートDNA合成

　すでにいろんなところで取り上げられているKunouseらのScience誌の論文ですが、本ブログでも取り上げないわけにはいかない極めて重要な論文です。合成だけでScienceに掲載されるのはインパクトとキラルなホスホロチオエートの話題性が高いということですね。Scripps研とBMS(Bristol-Myers Squibb)の共著で、サプリメントの資料も220ページでボリュームたっぷり。タイトルどおり、5価のリン化合物をモノマーユニットとして用いてキラルなホスホロチオエートDNA2量体やオリゴの合成を行なっています。

　リモネンから過酸化水素で酸化して合成したリモネンオキシドを不斉源として不斉リン化合物を合成しています。やはり天然の不斉炭素は重要ですね！。論文では、様々なエポキシを検討したような図が出ていましたが、比較実験のデータは見つけられませんでした。脱離基のSC6F5もしかり。
　得られたリン化合物をDBUの強塩基条件で、5'-水酸基が保護されたヌクレオシドと反応させることによって、3'-水酸基に導入しモノマーユニットとします。
　このユニットをさらにDBU存在下で5'-水酸基が遊離しているヌクレオシ(チ)ドと反応させることにより、ヌクレオチド間の結合がキラルなホスホロチオエートDNAを合成することができます(d.r. >99%)。
　ヌクレオチド2量体のほか、環状のヌクレオチド2量体、オリゴ合成に応用しています。
　素晴らしい！⭐️。

メリットは、
>5価のリンなので、空気酸化や加水分解を受けにくい。
>リモネンから誘導した不斉補助基で工程数が少ない、安い。
>塩基部位が無保護でもいける？。（←DBUでの反応中でアシル型の保護基は脱落している様子)
低分子の不斉ホスホロチオエートDNA合成には、5価のリンが使いやすい。STING、抗ウイルス剤などは、こちらが向いているとのことかな。

これからのところ、
オリゴ合成には縮合収率がいまいち。塩基部の反応性はどうなってるのか？保護基の有無など。
とくに水酸基と同じ求核種のチミジンのO4, グアノシンO6位との反応選択性についてどうなのかと思う。DMTrを活用したオリゴマー合成を考えた時には、塩基部の保護がDBUの条件下でも安定かつ、DMTr除去の酸性条件で安定な、オルソゴナルな保護基が必要なのかなと思いました。
サプリメント資料を真面目に読むと、塩基部アシル型の保護のモノマーを合成しているが、どうも収率があまりDMTr-Bz-A(Rp): 51%、DMTr-Bz-C(Rp): 45%、DMTr-iBu-G(Rp): 30%。それを用いて4塩基を含むオリゴ合成はやっているんだけど、本文には出してない、HPLCデータなし。

Science誌だから仕方ないのかもしれないですが、もう少し化学に関する議論があってもいいのにと思いました。サプリメント読むの疲れました。

過去記事: キラルなホスホロチオエート

シンポジウムレポ〜第４回核酸医薬学会年会

　今日までの3日間、九州大学医学部の100年会館で開催されていた核酸医薬学会の年会に参加してきました。昨年は行けていませんでしたので、全4回中3回の参加です。
今回は、初日の午前中までで490人が参加されているということで、かなり大勢。ポスター会場は、いっぱいで見たいポスターが見れない状態でした。
　前回は参加していないので、2年前からの比較になりますが、研究のレベルがかなり上がったと思いました。ちょっと目を話すとあっという間に取り残されてしまいそうという危機感をおぼえました。
　お世話になった、東京理科大の和田猛先生が栄えある核酸医薬学会賞を受賞されました。Wave Lifescienceの基盤技術であるキラルなホスホロチオエート核酸の合成についてです。和田先生、おめでとうございます！

　今回の年会で印象的だったのは、EPR効果の白黒がつきつつあるということ。
担癌マウスへ投与した場合、EPR効果でナノ粒子が癌にパッシブターゲッティングされ、KDを示すが、ヒトではことごとく失敗。カポジ肉腫ぐらいの血流のある腫瘍でしか使えない！ということが繰り返しの討論で述べられていました。マウスとヒトで違うし、担癌した腫瘍組織ってヒトのがんとは違う！ということですね。今後、アクティブターゲッティングに用いるリガンドの重要性がますます高くなるということですね。
　ヒトとマウスと違うところポイントは、CpGオリゴについても述べられていて、げっ歯類と霊長類で免疫系が異なるので、Checkmate PharmaceuticalsのKriegは、マウスの実験は、投資家がやれというからやるけれど、彼のphilothophyではやりたくない。得られるものが少ないというコメントが、私には強烈でした。
　個人的に今回、いろんな方とお話ができ、持って行った名刺を使い切ってしまいました。このブログを読んでくださっているという方が話かけて下さったりして、嬉しく思いました。更新が滞りがちで申し訳ありません。今回の投稿は、"化学"の要素が少ないのですが、化学目線で核酸についてゆっくり書いていきたいと思います。

RNA neobiology とは、

新年度に入って更新がストップしてました。すみません。

今年度の武田科学振興財団のシンポジウムのタイトルはRNA neobiologyだそうです。RNAが関与する新しい生物学ということなのでしょうか。non-cording RNAによる転写後の翻訳制御もさることながら、Crisper-Casも見つかってあっという間に一般化しましたね。Cas9タンパクの改変などすごいですね。dCas9(切らないCas9)に対して、DNAの脱メチル化酵素と融合タンパクでDNAのメチル化を解除したり、アデノシンやシチヂンの脱アミノ化酵素との融合でピンポイントで遺伝子編集したり、どんどん新たな派生技術が生まれています。これに続くような新しいbiologyの登場に期待ですね。

会期は2019年2月1日(金)２日(土)
6月から受付だそうです。
http://www.takeda-sci.or.jp/business/symposium_info.html
参加費無料、懇親会無料、遠方の方は研修所に宿泊可。宿泊棟でエンドレスの懇親会。ポスター賞50万円。
交通費はかかるけれど、未来ある学生さんには勉強するいい機会だと思います。
自分が学生の時は、目先の交通費の方が大切だった気がします😭。

LNA & 2',4'-BNA その2 合成法

LNA／BNAがどんなルートで合成されているか、核酸をやっている化学者であれば気になるところかなぁと思います。というので、ルートを書いてみました。大変参考になる反応ばかりです。BNA、LNAが初めて報告された際の合成ルートからかなり最適化が進んでいて、特にMs基が5'-OHと4'-CH2OHの両方に入った中間体を経由する事で、1級水酸基の保護基の位置異性体の生成回避ができています。分子内環化するのは、片一方だけです。

ちなみにMs基が2カ所入った誘導体は、購入もできます。

LNAの特許もこの夏切れるそうです。核酸化学も次の時代へ！

2′-Amino-LNA もトランスグリコシル化で

アミノLNAもなかなか有用な核酸の誘導体だとおもいますが、他の修飾体とおなじくプリンヌクレオシドの合成に手間がかかっていました。これは2′-水酸基の反転反応が、ピリミジンヌクレオシドでは確立されているが、プリンヌクレオシドではきびいしいからです。こちらの報告はマイルドな条件で、DMTr基がある基質でも使えるとのこと。
田辺三菱製薬でも研究が進んでいますね。国内でいろんな会社がどんどん核酸の研究をやっているってことですね。

Synthetic Method for 2′-Amino-LNA Bearing Any of the Four Nucleobases via a Transglycosylation Reaction: Synthetic Method for 2′-Amino-LNA Bearing Any of the Four Nucleobases via a Transglycosylation Reaction

追記(2018.3.28)
GuNA(グアニジン架橋型)の特許も公開されていますね(2018.3.23)。
結構なリソースがかかっていますね。
https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2017047816

第4回核酸医薬学会年会開催2018年7月9日〜11日＠福岡

第4回となる核酸医薬学会年会が7月に福岡で開催されます。
佐々木先生が年会長として取りまとめられるそうです。
できれば、わたしも参加したいと思っています。お声かけくださいませ。

今回は、託児所が設けられるそうです。女性研究者も多いですので、すごい良い試みなのではと思います。懇親会には子供さんと参加されるのかなぁ？と思いました。
日本核酸医薬学会第4回年会

シンポジウムレポ〜第3回革新的バイオ研究開発シンポジウム

　第3回革新的バイオ研究開発シンポジウム参加のため2月20日に大阪府豊中市の千里ライフサエンスセンターへ行ってきました。意見交換会では、顔見知りの方にお会いしたり、新しい方とお話できたり有意義な時間を過ごせました。わたしをご存知の方に「ブログやってるでしょう？」とお声がけいただきました。読んでいただけるというのは嬉しいものです。
　本シンポジウムは、大阪大学大学院薬学研究科小比賀聡先生主催、日本核酸医薬学会協賛、日本医療研究開発機構(AMED)後援で開催されました。メイントピックは、核酸医薬の開発ステージが進むにつれ問題となる毒性の課題克服に向けた取り組みについて。核酸医薬の毒性回避を目的とした研究が強力に推進されているというところからも、国内での核酸医薬開発のステージが上がっていることが分かりますね。今後がますます楽しみです。
　核酸医薬品を皮下または静脈へ投与した場合、投与後化合物濃度が上昇する肝および腎で毒性問題視されています。毒性回避に向けたさまざまな取り組みは、レギュラトリーサイエンスシンポジウムでも共通しますね。先生方が分類されている核酸毒性の分類図を拝借しました。シンポジウムの中でも何度も登場したので、スタンダードになっている図だと思います。

• オンターゲット: ターゲット遺伝子に起因した効果であるので、投与量のコントロールにより制御可能。ターゲットによっては毒性マージンが狭いターゲットも存在する。そもそものターゲット選択が悪かった可能性もある。
• 狭義のオフターゲット: ターゲット遺伝子以外に2本鎖形成することによって毒性が引き起こされる。バイオインフォマティックスを用いることによって目的遺伝子以外の遺伝子に対する2本鎖形成に起因するオフターゲットを予測することができる。最終候補品は、マイクロアレイによる確認も必要との議論。
• 広義のオフターゲット:タンパク質などへの結合による毒性。TLR3, 7, 8, 9は、核酸を認識する受容体であり、プラットホーム、配列によっては注意する必要がある。デリバリー目的に用いたコンジュゲート分子由来、リポソームの構成成分、不純物など製剤に含まれる様々な要因が考えられている。

大阪大学の小比賀先生は、「毒性ゼロに向けた革新的核酸医薬プラットホームの構築」というタイトルでご発表されていました。毒性回避のために構築した新たなプラットホームに関する発表で、ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドのタンパク結合に起因する広義のオフターゲット回避に向けた取り組みが発表されていました。プラットホーム構築に向け具体的には、以下の実験が行われていた。

 

1. GGGenome、GGRNAを用いた配列検索により、ヒト、マウスの遺伝子と相同性のない配列をピップアップし合成する。（オンターゲット、狭義のオフターゲット作用のない配列選択）
2. in vitro試験でTLR9のアゴニスト作用のない配列に絞り込む。（広義のオフターゲットのうちのTLR9活性化作用のない配列を選択、TLR9は1本鎖DNAを認識する受容体であるため）
3. 絞り込まれた配列をマウスに投与することによって、肝臓への毒性のある核酸塩基配列を同定した。(配列は非開示)

　

肝毒性の指標はALT/ASTを使用、マウス投与に用いられた核酸はLNAのホスホロチオエートギャップマー構造3-8-3型であった。得られた配列(HTS-1と命名)のwindow領域(天然型のDNA)の核酸塩基部位に修飾を導入することによって、HTS-1配列で認められたALTの値をオリジナルの1%以下まで低下させることに成功した。核酸塩基部の修飾はピリミジン塩基5位またはプリン7位または8位修飾体を利用している。詳細な構造は非開示であった。